产品中心
PRODUCT CENTER
快速抗体纯化磁珠
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货号 |
产品名称 |
产品规格 |
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EA101 |
BcMag ™ 快速抗体纯化试剂盒 |
2 ml （纯化高达10mg IgG） |
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EA102 |
BcMag ™ 快速抗体纯化试剂盒 |
10 ml （纯化高达50mg IgG） |
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运输条件: 常温运输
储存条件: 在4ºC储存试剂盒。
原理
可以使用以4-巯基-乙基吡啶为配体的疏水电荷诱导色谱法从各种生物物质中分离抗体（图1）。结合基于温和的疏水结合方式，并且在接近生理的情况下完成，不需要使用盐。当pH降低时，配体和抗体在温和的酸性环境（pH 4.0-4.5）下获得净正电荷。
与更传统的抗体纯化方法（如蛋白A或离子交换）相比，HCIC具有几个工艺优势：
• 样品制备时减少对样品的损伤，因为磁珠可以在没有离子强度或极端pH调节的情况下使用。
• 对样品中目标产物浓度低的现象不需要预浓缩，因为即使原样品稀释至每毫升40ug抗体，也可以实现有效捕获。
• 用稀释缓冲液进行温和的pH控制洗脱可降低在较低pH下抗体聚集的可能性，并避免需要IgG脱盐或渗滤。
磁珠产品与传统色谱法如纯化柱、琼脂糖或非磁性树脂相比具有显著优势。基于磁珠的特性可以在约20分钟内快速高产率处理96个样品，不同IgG种类抗体纯化产物获得超过80％纯度和超过90％回收率。当使用基于色谱柱的技术实验时，在科学研究实验室处理多个样品时，可能需要大量的手动移液操作。这种移液操作会造成实验和人之间目标生物分子产量的差异。实验人员和学生可能需要大量的培训和实践才能产生恒定的蛋白质产量。而且磁珠具有许多优点，例如它们易于使用，快速的实验方案，适用性以及高通量自动化和小型化处理的便利性等。
工作流程（图2）
使用色谱法分离复杂混合物中存在的抗体涉及结合珠子的抗体。结合后，洗涤磁珠以除去非抗体蛋白。最后，从磁珠上洗脱抗体。
功能和优点
• 高效 - 回收率超过90％，纯度超过85％。
• 快速纯化 - 一步法手动或一步法高通量操作。
• 便捷 -无需使用纯化柱、过滤器，且不需要繁琐的移液或离心操作。
• 不含胺基缓冲液 - 无需进行去除或中和操作。
• 结合力强 - 适用于对蛋白A或蛋白G结合能力较差的IgG亚类。
• 温和 - 无需苛刻的抗体洗脱条件，有助于保持IgG的活性。
• 可再生 - 磁珠可重复使用，可进行多达3次纯化。
操作协议
提示：
• 以下方案是从血清中纯化抗体的例子。
• 磁珠和样品体积可以合理放大（或缩小）。
缓冲液：
• 2x结合/洗涤缓冲液：25 mM磷酸钠，pH 8.5
• 洗脱缓冲液：20 mM乙酸钠，pH 4.0100 mM NaCl
• 再生缓冲液：35 mM磷酸钠；30%正丙醇，pH 8.5
仪器要求
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Item |
Source |
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磁力分离器
**根据样品体积，用户可以选择以下磁力分离器之一 |
l BcMag™ separator-2 适用于两个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag™ separator-6 适用于六个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag™ separator-24 适用于24个单独的1.5-2.0 ml离心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag™ separator-50 适用于1个单独的50毫升离心管，1个单独的15毫升离心管, 以及4个 1.5毫升 离心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分离器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分离器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可调单通道和多通道移液器 |
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摆斗离心机 |
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如果使用96孔PCR板/管，则需要添加项目 |
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涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf™ MixMate™ |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24 × 1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 离心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，确保PCR管或PCR板锥形部分底部的井径必须≥2.5毫米。 |
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如果使用96孔微孔板需要添加的设备 |
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Fisher Scientific™ Microplate Advanced Vortex Mixers |
Fisher, Cat#:02-216-101 |
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OHAUS Microplate Vortex Mixers |
OHAUS, Cat#:30392160 |
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涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥800 rpm |
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平底透明的非结合型分析微孔板 |
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实验步骤
重要提示：
• 以下方案针对3µl血清样品的高效纯化进行的优化。如果进行其他反应，则可能需要进行程序优化。
• 在使用前，摇晃或涡旋混合试剂瓶，完全重悬磁珠。
• 不要让磁珠静置超过两分钟。
A. 样品制备
1. 用等体积的2x结合/洗涤缓冲液稀释全血清并充分混合。
B. 磁珠制备
1. 摇动试剂瓶以完全重悬磁珠。
2. 将所需量的磁珠转移到离心管中（注意：1ml的 BcMag™ 快速抗体纯化磁珠，建议用于0.5-1毫升全血清纯化使用。可以相应地缩放体积。血清中的IgG水平通常为10-15mg/ml）。将试管放在磁性支架上1-3分钟，直到上清液变清。在管保持在支架上的同时除去上清液。
3. 取出试管，用10倍磁珠体积的1x结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。
C. 样品结合
1. 将步骤B.4中洗涤过的磁珠添加到步骤A1中稀释的样品中。将磁珠完全重悬，并在室温下放置10-30分钟，并进行颠倒旋转。
2. 将试管放在磁性支架上1-3分钟。在管保持在支架上的同时除去上清液。从支架上取下试管，用10倍磁珠体积的1x结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠。
3. 重复步骤3五次
D. IgG洗脱
1. 从支架上取下试管，用10倍磁珠体积的洗脱缓冲液重悬磁珠以洗脱IgG。将试管放在磁性支架上1-3分钟。在管保持在支架上的同时移走上清液。
小型高通量净化
1. 将50µl磁珠（步骤B4）转移到96孔PCR板或96孔微孔板或0.2ml PCR管的新孔中，并将A1中稀释的血清吸取20µl加入。
2. 通过缓慢上下移液25次（一分钟）或通过涡旋混合器以2000 rpm混合5分钟，将磁珠与样品混合。
3. 将样品板/管放在磁分离板上30秒或直到溶液澄清。
4. 丢弃上清液，并使用磁力架用100µl 1x结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。
5. 加入50µl洗脱缓冲液，通过缓慢上下移液25次（一分钟）或以2000 rpm的速度涡旋混合器5分钟来洗脱抗体。
6. 将样品板/管放在磁分离板上30秒或直到溶液澄清。
7. 将上清液转移到干净的板/管中，同时样品板保持在磁分离板上。该样本已准备好用于下游应用。
附加信息：
磁珠再生
1. 如果必须再生磁珠，则添加10ml 35 mM磷酸钠；30%正丙醇，pH 8.5缓冲液，用于1 ml磁珠再生，并通过缓慢上下移液25次将磁珠与样品混合。将样品板/管放在磁分离板上30秒或直到溶液澄清。丢弃上清液。
2. 重复步骤1五次。
3. 用10倍磁珠体积的1x结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠三次
4. 将磁珠重悬于1x结合/洗涤缓冲液中，并保存在4°C。磁珠可以再生三次而不会失去实质性的选择性。
故障排除
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问题 |
可能的原因 |
建议 |
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纯化抗体的产量太低或检测不到 |
没有抗体的样品 |
• 通过使用其他方法（例如ELISA或同种型试剂盒）确保样品含有IgG。 |
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感兴趣的抗体不与磁珠结合 |
• 确保样品的pH值在8.5之间。 |
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观察染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上存在多条带 |
磁珠和样品的比例没有得到优化。 |
• 用1x biding/wash缓冲液透析样品。 • 优化珠子和样品的比例 |
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纯化了大量抗体。然而，没有发现感兴趣的抗体。 |
感兴趣的抗体浓度低。 |
• 利用活性亲和磁珠和特异性抗原纯化抗体。 |
