蛋白 A磁珠

运输条件: 常温运输

储存条件: 收到后，根据试剂盒要求储存.

简介 

BcMag™ Protein A Magnetic Beads 是大容量、高通量的亲和磁珠，用于抗体纯化和免疫沉淀实验，可使用手动或全自动仪器操作。这种磁性微球表面共价固定了高密度，超纯（纯度>97%）的重组蛋白A。蛋白A磁珠用于从血清、细胞培养上清液或腹水中纯化抗体，以及从细胞或组织提取物中纯化抗原IP/Co IP。我们对蛋白A磁珠的操作步骤进行了改进，使目标抗体或抗原的回收率和纯度达到最大。对于纯化抗体，将磁珠与抗体溶液一起孵育，磁珠通过磁力从上清液中分离。对于免疫沉淀反应，将链接有抗体的磁珠加入到含有抗原的样本中，并进行孵化以形成抗体-抗原复合物。使用洗脱缓冲液将附着的抗体或抗原从磁珠上分离，并使用磁力分离器手动从溶液中回收或使用自动化仪器回收。

A蛋白是一种结合在细胞壁上的蛋白抗体，来源于金黄色葡萄球菌。它包括一条含有很少或没有碳水化合物的多肽链，其分子量为42kDa。它由一个信号序列、五个串联排列的免疫球蛋白结合结构域E-D-a-B-C组成，每个结合结构域可以与来自各种哺乳动物IgG蛋白  H2-CH3的重链恒定区（Fc）和一个细胞壁结合结构域强力结合。重组蛋白A比天然蛋白A具有更高的结合容量和更优良的特异性IgG结合效率，因为它只保留了与IgG结合的结构域。蛋白质A可以与来自各种动物的抗体结合，包括小鼠、人类、兔子、猪、狗和猫。表1列出了抗体结合特性。

特点及优势

· 适用于快捷，简便的一步高通量程序---无需纯化柱或过滤器，或者重复的移液或离心

· 高效----与其他同类型磁珠相比，表面连接有更多的IP靶抗原。

· 极低的非特异性结合---稳定的预活化磁珠，提供高纯度的纯化结果

· 结果一致性-----与仅依靠离心的经典IP方法相比，磁珠减少了材料损失，并提供了更有效的分离结果。

· 磁珠用途广泛，既可用于人工操作，也可用于自动化操作。

应用

· 免疫沉淀，包括IP, Co-IP, ChiP, RIP

· 细胞分选

· 抗体的高通量筛选和纯化

使用说明

抗体纯化

使用蛋白A磁珠从血清中纯化抗体为例，一般纯化方案如下(Fig.1):

Protocol

1. Materials Required

缓冲液成分

l BcMag™.Protein A Beads (悬浮在10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA,1 mM EDTA, pH7.4, 0.1% NaN3缓冲液中)

l 1x Protein A Binding/Washing Buffer (57.7 mM Na2HPO4,42.3 mM NaH2PO4, pH 7.0)

l 1x Protein A Elution Buffer (0.2 M Glycine/HCl,pH 2.5)

l 1x Protein A Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)

所需耗材

l 磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择一下不同型号的磁力分离器：

BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);

BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);

BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);

BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);

BcMag™ separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05)；对于大体积生物样品纯化，可选用陶瓷磁体块分离器（6英寸x 4英寸x 1英寸氧化铁磁体块，应用磁体，Cat# CERAMIC-B8）。

l Corning 430825 细胞培养瓶适用于大规模纯化(Cole-Parmer,  Cat#EW-01936-22)

l Mini  BlotBoy 3D摇床，定速型，小型10x 7.5平台，带平垫（Benchmark Scientific, Inc. Cat# B3D1008）或类似型号

操作过程

提示：

l 该方案是经过优化的，可用于纯化来自不同来源的大多数IgG抗体。然而，由于没有两种抗体完全相同，因此不可能为所有IgG纯化设计一个通用试剂盒。为了获得最佳结果，每个用户必须根据故障排除部分中的建议，确定纯化单个抗体时的最佳工作条件，尤其是弱结合抗体（见表1）。

l 为确保离子强度和pH值的最佳结合条件，有必要在纯化前用Binding/ Washing buffer按照至少1:1比例稀释血清样品、腹水或组织培养物。通过离心或0.2μm过滤器过滤，去除样品中的任何不溶性物质。

l 在纯化IgG之前，用户应将试剂盒中包含的所有试剂平衡至室温，并通过用4倍体积双蒸馏水稀释5x stock solutions制成1x working solutions。

A.  磁珠预处理

1. 轻轻摇动装有BcMag ™蛋白质A磁珠的瓶子，直到磁珠完全悬浮。将适量的磁珠转移到新的试管中。

提示：

l 每个用户应根据粗样品中的IgG量，根据经验确定使用的最佳磁珠量。过多的磁珠会导致很高的背景;太少会降低蛋白产量。我们建议每100μg IgG抗体添加100μl完全悬浮的磁珠。通常，高效价兔抗血清的IgG含量约为5mg/ml，小鼠腹水的IgG含量约为10mg/ml，山羊或绵羊抗血清的IgG含量约为20mg/ml。

l 在分液之前，不要让悬浮的磁珠放置超过5分钟。每隔3分钟对磁珠进行一次混匀。

2. 将试管放在磁力分离器上1分钟。当试管留在磁力分离器上，上清液完全澄清时，去除上清液。将试管从分离器上取下，并使用5倍体积的1x Binding/Washing Buffer通过漩涡清洗磁珠。再将试管放在磁力分离器上1分钟。当试管留在磁力分离器上，上清液完全澄清时，去除上清液。

3. 重复步骤 (2)一次. 清洗过的磁珠即可用于纯化实验.

B.   纯化

1. 向样品中加入等体积的1x Binding/Washing Buffer并充分混合。

2. 将清洗好的磁珠[步骤A（3）]混合到样品中，并在室温下，使用Mini BlotBoy 3D Rocker连续旋转孵育5-10分钟或在4ºC下孵育30-45分钟。

3. 将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当试管留在磁力分离器上，上清液完全澄清时，去除上清液。将试管从分离器上取下，并使用10倍体积的1x Binding/Washing Buffer通过颠倒混匀10次清洗磁珠。再将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当试管留在磁力分离器上，上清液完全澄清时，去除上清液。

4. 重复步骤(3) 六次.

提示：

l 这一步骤对于获得高纯度蛋白质至关重要。对于某些蛋白质来说，可能需要清洗磁珠六次以上，以减少非特异性结合。

l 在结合/洗涤缓冲液中加入非离子洗涤剂（0.5%Triton X 100，0.5%Tween 20），也可以减少非特异性结合。

5.  加入适量的Elution Buffer，通过上下移液10-12次或涡旋混匀搅拌5分钟。

6.  收集含有抗体的上清液并将其转移到新的试管中。并立即加入1/10体积的neutralization buffer并充分混合，中和洗脱的抗体溶液。

问题及解答:

1. 有时候，为什么I gG不能从磁珠中洗脱？

l 洗脱缓冲液的pH值可能不正确。正确的pH值应为2.5。

l 洗脱条件太温和，无法洗脱抗体

l 因为一些抗体只能在pH值为2.0时洗脱。

2. 免疫反应洗脱抗体的丢失或产量低的原因是什么？

一旦洗脱缓冲液通过添加中和缓冲液立即中和，它将不会影响大多数抗体的免疫反应性。然而，一些抗体（例如，一些单克隆抗体）不耐酸，并且在非常低的pH值下会不可逆转地失去活性。对于那些对低pH敏感的抗体，一步法抗体纯化试剂盒是传统抗体纯化的替代方法。该试剂盒是一种快速、一步法、可有效的从血清和其他样本类型中分离抗体的方法。磁珠结合并去除血清蛋白，从而在上清液中收集到纯IgG（图2）。由于不涉及苛刻的洗脱条件，抗体活性可100%保存。    

3. 为什么在抗体洗脱溶液中观察到多条带？

某些宿主蛋白可能与目标抗体发生非特异性相互作用。用户可在结合和洗脱缓冲液中添加NaCl（50-200mM，最终浓度）。

免疫沉淀方案

A.所需额外材料

•1.5mL微量离心管

•用于免疫沉淀的抗体

•抗原样品

•裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl pH 8，137 mM NaCl，1%Nonidet P-40（NP-40），2 mM EDTA。可在4℃条件下储存6个月。使用前立即添加蛋白酶抑制剂。

•清洗缓冲液：10mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，1mM EGTA；pH 8.0，0.5 M NaCl，1% Triton X-100，0.05%吐温-20 0.2 M原钒酸钠，蛋白酶抑制剂混合物。在4°C条件下储存6个月。使用前立即添加蛋白酶抑制剂。0.05%吐温-20去垢剂和0.5M  NaCl

•洗脱缓冲液（0.2 M甘氨酸/HCl，pH 2.5）

•中和缓冲液（1.0 M Tris-HCl，pH 9.0）

A. 磁力分离器

l 磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择一下不同型号的磁力分离器：

BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);

BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);

BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);

BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);

BcMag™ separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05)；

B. 免疫沉淀操作

提示：本方案是免疫沉淀的一个例子，使用者需要对每种不同应用进行优化。

1.样品制备

a. 粘附细胞

a） 将细胞培养皿或烧瓶置于冰上，清除培养基，并用冷藏过的PBS缓冲液清洗细胞。

b）清除PBS缓冲液，然后加入适当体积的冷藏的裂解缓冲液（每1毫升含有10⁷个细胞/100 mm²培养皿/150 cm²烧瓶；或每0.5毫升含有5x10⁶个细胞/60 mm²培养皿或75 cm²烧瓶）

注：优化裂解缓冲液的体积是必要的，以确保完全裂解细胞和确定最终裂解产物中最佳的蛋白质浓度。

c） 在冰上孵育20分钟，然后用细胞刮刀将粘附细胞从培养皿或烧瓶中刮下，将细胞悬浮液转移到微量离心管中，并在4℃下，以13000rpm离心10分钟以收集裂解上清液。

d） 将上清液（避开沉淀）收集到一个新的微量离心管中。通过适当的方法测定蛋白质浓度。

e） 继续进行免疫沉淀或在-20°C或-80°C下储存，直到需要为止。

b. 悬浮细胞

a） 将细胞转移到锥形管中。

b） 在室温下以1400rpm 的低速离心5分钟，使细胞沉淀，并吸出培养基。

c） 用10ml 冷藏的PBS缓冲液洗涤细胞。

d） 以低速（1400 rpm）离心细胞，去除PBS清洗缓冲液。

e） 重复清洗步骤。

f） 加入适当体积的冷藏的裂解缓冲液（每2 x 10⁶个细胞加入10ul至100µl），并在冰上孵育细胞30min。

提示：如有必要，将裂解物在冰上超声处理20-30秒，以破坏基因组DNA和细胞成分。

g） 在4ºC下以13000rpm离心10min

h） 将上清液收集到新的试管中，并通过适当的方法测定蛋白质浓度。用裂解缓冲液将浓度调节至2.5 mg/ml。

i） 继续进行免疫沉淀或在-20°C或-80°C下储存，直到需要为止。

c. 组织细胞的裂解

a） 将生物组织切成小块，用冷藏的PBS清洗两次。

b） 将约5 mg切碎的组织转移到试管中，并加入300µl冷藏的裂解缓冲液。用电动均化器进行均化或在冰上进行超声处理。

c） 在4℃下，以14000rpm的转速离心10min。

d） 将上清液收集到新的试管中。通过适当的方法测定蛋白质浓度。

e） 继续进行免疫沉淀或在-20℃或-80℃下储存，直到需要为止。 

2.   将100-150μg细胞裂解物与适量抗体在1.5mL离心管中混匀，并用细胞裂解缓冲液将反应体积调至400-500µL。在室温下孵育反应1-2小时，或在4ºC下连续旋转过夜。

提示：优化每次应用所用抗体的数量是必要的。过量的抗体会导致较高的背景值。抗体不足会导致结合效率下降。需要进行中试实验来确定，与目标蛋白质结合的抗体的最佳加入比例。通常在这类实验当中，通过增加抗体的加入量，来确定固定量目标蛋白质最佳的抗体加入浓度。以下是抗体使用的一般操作说明。对于单个抗体，请查看抗体说明书中推荐的抗体浓度。

对于100–150μg细胞裂解物，使用：

•1-5μL多克隆抗血清

•1μg亲和纯化的多克隆抗体

•0.2–1μL腹水（单克隆抗体）

•20–100μL细胞培养上清液（单克隆抗体）

3.将适量BcMag™蛋白G磁珠放入到1.5mL的离心管中。

提示：

•使用前震荡试剂瓶，直到磁珠变得均匀。

•使用的磁珠量通常由磁珠的抗体结合能力（约60µg IgG/mg）和所用抗体类型来确定。

•在吸取磁珠溶液前，不要让磁珠静置超过5分钟。每隔3分钟对磁珠进行一次混匀。

4.用1ml清洗缓冲液清洗磁珠，轻轻涡旋混合。用磁力分离器收集磁珠，并清除上清液。

5.将抗原样品/抗体混合物加入到预先清洗过的磁珠中，并在室温下连续旋转孵育1小时。

6.用磁力分离器收集磁珠，取出上清液，并保存起来进行分析。

7.加入500µL清洗缓冲液，通过移液器吹吸混匀10次，清洗磁珠。收集磁珠并清除上清液。

8.重复清洗两次，直到上清液在280nm处的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

提示：向清洗缓冲液中添加高浓度的盐、非离子去垢剂和还原剂可以减少非特异性背景值。例如，我们向清洗缓冲液中添加NaCl（高达1-1.5M）、0.1-0.5%的非离子去垢剂（如Triton X 100或Tween 20）和还原试剂如DTT或TCEP（通常为3mM）。

9.向试管中加入500µL超纯水，轻轻混合。在磁力分离器收集磁珠并去掉上清液。

10.加入10-100µL洗脱缓冲液，用移液器上下吹吸10-20次。将上清液收集到新试管中。添加的1/10体积的中和缓冲液。

问题解答.