多肽结合试剂盒（II）

运输条件：室温运输

储存：根据上表要求，在收到试剂盒时储存各成分。

通过氨基以外的官能团固定亲和配体，对实验也是非常有帮助的。特别是使用硫醇基团，非常适用于引导特定蛋白质分子上结合位点，或活性中心距离较远的偶联过程。使用独特的活性基团进行定点固定，有利于正确定位，例如多肽中单个末端半胱氨酸上的巯基用于小抗原结合。

BcMag ™ 多肽结合试剂盒旨在通过巯基（-SH）快速，高效和共价固定小分子多肽，用于亲和纯化操作。BcMag ™可切割的碘乙酰基活化磁珠被建议用于与小分子多肽结合，因为长臂亲水接头可以减少空间位阻。由于活化的碘代乙酰基通过内置的可裂解二硫键与充值连接（图1），使用还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）可以裂解并将目标分子-配体复合物与磁珠分离，亲和纯化完成后只有一个巯基附着在配体上。

BcMag ™ 可分离式碘代乙酰基活化磁珠（图2）是均匀的二氧化硅基质的超顺磁珠，表面连接有高密度的碘乙酰基或可裂解的碘乙酰基官能团。在碱性生理环境（pH 7.2--9）下，在含有20-30%DMSO或DMF的水性或有机溶剂中，碘代乙酰基活化的载体与巯基反应，产生稳定的硫醚键。这些反应通常在黑暗环境下进行，以防止游离碘的形成，因为游离碘可与酪氨酸，组氨酸和色氨酸残基反应。

工作流程

碘代乙酰基磁珠作为固体载体可以完美地用于各种亲和纯化，将分子，细胞和部分细胞进行纯化。只需要与配体结合后，将磁珠添加到含有目标分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脱目标分子（图3）

功能和优点。

· 碘代乙酰基可与巯基（-SH）选择性反应产生不可逆的硫醚键。

· 快速---在2小时内快速结合多肽样品。

· 适用于多种结合条件----根据偶联反应期间蛋白质或多肽溶解度的需要，在pH 7.5至9.0范围内，适用于水性缓冲液、有机溶剂（例如，20%DMSO）或变性剂（盐酸胍）中使用。

· 样品制备、固定和亲和纯化的操作方法非常简单

· 高结合量----- 磁珠结合量可达到15-20µg抗体/mg磁珠。

应用领域：

· 用半胱氨酸残基末端固定多肽，以纯化针对肽免疫原产生的抗体。

· 使用铰链区的巯基，以定向方式固定抗体，以确保在进行抗原亲和纯化时，抗原结合位点不会受到空间抑制。

· 生成可重复使用的免疫亲和矩阵

· 维持抗体功能通过Fc区固定IgG，使两个抗原结合位点均可用于靶标捕获。

使用协议

注意：

§ 该协议可以根据需要扩大规模。我们强烈建议使用滴定法优化每个实验中使用的磁珠数量。.

所需材料

§ 结合缓冲液

1. 可溶性结联缓冲液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5；

2. 不可溶性结联缓冲液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5，20-30%DMSO或DMF或6 M胍•HCl

§ 清洗缓冲液： 1 M的氯化钠（NaCl）溶解在蒸馏水中

§ L-半胱氨酸•HCl

§ TCEP（三(2-羰基乙基)磷酸盐）

§ 磷酸盐缓冲液（PBS）

§ BcMag^TM碘代乙酰基活化磁珠：用户可以根据要求选择不同的碘乙酰基活化磁珠：1µm BcMag™ 长臂碘乙酰基活化磁珠，2.5µm 长臂碘乙酰基活化磁珠，5µm  BcMag™ 长臂碘乙酰基激活，1µm BcMag™ 可分离式碘乙酰基活化磁珠，或2.5µm BcMag™ 可分离式碘乙酰基活化磁珠。

§ 磁力架

根据样本量，用户可以选择以下磁力架之一：

1. BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);

2.  BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);

3. BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);

4. BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);

5. BcMag™ separator-96可配套使用 96孔 ELISA板或者96孔PCR板 (Cat.# MS-05).

A．样品准备

提示：

l 确保要结合的蛋白质/肽含有游离（还原）巯基。为了确保还原巯基可用，必须用还原剂还原二硫键，如DTT（二硫苏糖醇）、TCEP（三（2-羧乙基）膦）或2-MEA（2-巯基乙胺•HCl），然后脱盐或透析以去除还原剂。

l 如果重组后立即使用，新合成的肽可直接用于偶联

l 对于蛋白质，在室温下用5-10 mM TCEP溶液处理蛋白质30分钟，然后进行透析或脱盐柱。对于IgG抗体，推荐使用2-MEA，因为它可以选择性地减少铰链区的二硫键。

l 如果样品含有含有游离巯基的还原剂（如2-巯基乙醇、DTT或TCEP），则必须通过透析或脱盐将这些还原剂完全去除。

1. 如果为可溶性蛋白，将1-10mg蛋白质/肽溶解在1ml的soluble coupling buffer中。如果不溶，则溶解在1ml的Insoluble coupling buffer中。

2. 如果样品已经悬浮在其他缓冲液中，则用等量的结合缓冲液稀释样品。

B、 磁珠制备

1.  用100%丙酮（30 mg/ml）制备3%磁珠。

提示：将未使用的磁珠储存在4℃的丙酮溶液中。可稳定保存一年。

 2.  将100µl（3mg）磁珠转移到离心管中。

3.   将试管放在磁力架上1-3分钟。在试管保持留在磁力架上的同时，去除上清液。从磁力架上取下试管，并通过涡旋将磁子用1ml结联缓冲液重悬30秒。

4.  重复步骤3两次。

5.除去上清液，清洗后的磁珠已可以用于偶联反应。

注意：使用偶联缓冲液再水化后，由于官能团的稳定性，请尽快使用磁珠。

C. 结合反应

1. 向清洗过的磁珠中加入100µl配体溶液，充分混合，并将样品在室温下于黑暗中孵育过夜，并充分混合。

2. 用1ml结合缓冲液清洗磁珠四次。

3. 阻断磁珠上多余的活性基团，通过将磁珠悬浮在含有8mg L-Cysteine•HCl的1ml Coupling buffer中，并在室温下缓慢旋转培养30-60分钟。

4. 用1ml清洗缓冲液洗涤磁珠四次。

5. 将磁珠重悬于含有0.05%叠氮化钠的PBS缓冲液中，并将其保存在4℃。

D、常见亲和纯化过程

提示：

l 该方案是一个通用的亲和纯化发法。因为没有两种蛋白质是完全相同的，所以不可能为所有的蛋白质纯化设计一个通用的协议。为了获得最佳结果，每个用户必须确定纯化单个目标蛋白的最佳工作条件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用还原剂。

l 强烈建议根据粗样品中目标蛋白质的含量，进行滴定，以优化每个单独实验中使用的磁珠数量。使用过多的磁珠  

将导致较高的背景，而使用过少的磁珠将导致较低的产量。每毫克磁珠通常可与1-20μg靶蛋白结合。

1.将适量的珠子转移到离心管中。将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。

2. 取下试管，加入5倍磁珠溶液体积的PBS缓冲液，通过震荡重新悬浮磁珠，涡旋30

秒。将试管至于室温环境1-3分钟，再将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。

3.重复步骤2 两次。

4. 向含有目标蛋白质的粗样品中添加洗涤过的磁珠，并在室温或所需温度下温浴1-2小时（温度越低，培养时间越长）。

提示：强烈建议进行滴定实验以优化培养时间。因为孵化的时间太长可能会导致很高的背景。

5. 用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl彻底清洗磁珠，直到280nm处洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

              提示：添加更高浓度的盐、非离子洗涤剂和还原剂也可能会降低非特异性背景。例如，向洗涤缓冲液中添加NaCl（浓度为1-1.5 M）、0.1-0.5%的非离子洗涤剂，如Triton X-100或Tween-20，以及还原剂，如DTT或TCEP（我们通常使用3mM）。

6. 通过适当的方法，如低pH（2-4）、高pH（10-12）、高盐、高温、亲和洗脱或SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸，洗脱目标蛋白。

7.切断二硫键

提升：由于配体之间的构象不同，用户应确定最佳工作条件，如还原剂、pH值和温度，以切割单个配体的二硫键。以下是从磁珠上切割共轭的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巯基乙醇或5 mM DTT（二硫苏糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巯基乙醇条件下，室温2小时或

者过夜孵育，或者在98℃条件下5分钟。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT条件下，室温2小时或者过夜孵

育，或者在98℃条件下5分钟。