产品中心
PRODUCT CENTER
糖蛋白和抗体结合试剂盒（II）
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货号 |
产品名称 |
产品规格 |
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FD107 |
BcMag™ 糖蛋白和抗体结合试剂盒（II） |
一个 |
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存储条件 |
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2.5µm BcMag™ 可分离式酰肼基磁珠 |
4℃ |
150mg |
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10x结合缓冲器 |
4℃ |
10ml |
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氧化剂（NaIO4） |
4℃ |
100mg |
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5 x洗涤缓冲液 |
4℃ |
15ml |
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10xPBS |
4℃ |
5.0ml |
储存：收到产品时，将试剂盒储存在4ºC。
BcMag ™ 糖蛋白和抗体结合试剂盒能够运用蛋白质上羰基酮或醛的相似基团在生物化合物中形成固定位点。这些位点使共价结合位点远离活性中心或结合区域。糖复合物如糖蛋白和糖脂在相邻碳原子上含有具有羟基的糖残基。用高碘酸钠氧化这些顺式二醇就会产生可用作共价固定位点的醛基。
本试剂盒使用酰肼基活化磁珠和特定催化剂产生与糖蛋白和抗体的亲和力。单克隆抗体和糖基化蛋白可以用高碘酸盐氧化的碳水化合物基团固定，以产生可重复使用的亲和基质。这种使用酰肼基团化学固定的抗体，具有抗原结合位不会受到阻碍的有点，和对抗体具有优良的纯化能力。在含有催化剂的，简单的非胺缓冲液中，完全偶联只需要2至4小时。抗体和常见糖蛋白的偶联效率通常大于85%，每毫克的酰肼基磁珠可以固定15µg至20µg蛋白。用稳定的糖蛋白或抗体制备的基质可以再生并重复使用至少五次，而不会明显丧失结合能力。
BcMag ™ 酰肼基磁珠是在表面连接有高密度酰肼官能团的均匀磁珠。酰肼基磁珠可通过低聚糖部分，定点固定含醛或酮的配体，例如抗体、凝集素、糖蛋白、糖和碳水化合物等。而且，酰肼基仅在Fc区域或附近结合，不会对抗体功能产生不利影响。以这种选择性地与靶向分子Fc部分的重链结合的方式偶联抗体，有助于Fv区域末端尽可能最好地保存抗原结合活性。在pH 5至7条件下，酰肼基的载体和化合物将与氧化碳水化合物的羰基结合，从而产生腙键（图1）。酰肼基磁珠珠适合结合较大的糖蛋白和糖脂，碳水化合物或其他配体。它的亲水性表面基团保证了磁珠在实验过程中，具有极低的非特异性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各种缓冲液中处理。
工作流程
本款磁珠可以完美地作为亲和树脂进行亲和纯化，将分子、细胞和部分细胞提取物进行提炼纯化。在与配体结合后，将磁珠添加到含有目标分子的样品中，然后混合、孵育、洗涤和洗脱目标分子。
功能和优点。
· 特异性的固定反应------酰肼基活化磁珠仅会与，已被高碘酸盐（例如唾液酸）轻度氧化的，含有糖基的纯糖蛋白结合。
· 稳定的共价键，低水平的配体泄漏
· 维持抗体功能-----通过Fc区固定IgG，保留两个抗原结合位点，均可用于靶目标的捕获。
· 极低的非特异性结合率
· 极高的固定容量：15-20µg抗体/mg磁珠。
操作协议
提示
l 强烈建议在实验过程中进行滴定优化，以确定每个实验中应用的磁珠数量。该协议可以相应地放大和缩小。
l 应避免使用含有伯胺基团或糖类的Tris或其他缓冲液，因为它们会与预期的
偶联反应物竞争结合磁珠。
所需耗材
1.磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择一下不同型号的磁力分离器：
BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);
BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);
BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);
BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);
BcMag™ separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).
2.Coupling Buffer: 0.1 M 磷酸钠, pH 7.0
3.氧化剂: Sodium meta-Periodate (NaIO4) (Sigma, Cat# S1878)
4.Washing Buffer: 1M NaCl
5.PBS
配体的偶联反应
A. 磁珠的准备
1.称取30 mg磁珠，并将其加入到1.5 ml离心管中。
2.加入1毫升coupling buffer，并通过涡旋或移液器吹吸方式将磁珠充分悬浮。
3.将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
4.将清洗的磁珠准备进行耦合反应。
B.糖蛋白或其他配体的氧化
注意：该反应对光敏感，应在黑暗中进行。
1.将0.5-10 mg糖蛋白或者其他配体溶解或稀释于1 ml Coupling Buffer中。（注：如果蛋白质或者其他配体已经悬浮在其他缓冲液中，则通过透析脱盐柱进行缓冲液交换。）
2.将蛋白质其他配体溶液添加到含有2 mg高碘酸钠（最终浓度为10 mM）的棕色小瓶中。轻轻旋转以溶解氧化剂。
3.在室温下，将样品在黑暗中缓慢旋转孵育45分钟。
C.偶联反应
1. 将氧化后的蛋白质或其他配体溶液添加到步骤A4制备的磁珠中，并通过旋转或移液器吹吸方式充分混合。
提示：偶联效率取决于目标糖蛋白或其他配体的结构和大小。用户应根据经验优化蛋白质与磁珠的比例。
2. 在室温下，在黑暗中孵育反应过夜，过程中保持充分混合
3. 将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。取下试管，用5ml的Coupling buffer通过涡悬或者吹吸重新悬浮磁珠。
4. 重复步骤3三次。
5. 用含有0.1%叠氮化物（w/v）的PBS缓冲液重新悬浮磁珠至所需浓度，在4°C下储存，直至使用。不要冷冻保存。
D、常见亲和纯化过程
提示：
l 该方案是一个通用的亲和纯化发法。因为没有两种蛋白质是完全相同的，所以不可能为所有的蛋白质纯化设计一个通用的协议。为了获得最佳结果，每个用户必须确定纯化单个目标蛋白的最佳工作条件。
l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用还原剂。
l 强烈建议根据粗样品中目标蛋白质的含量，进行滴定，以优化每个单独实验中使用的磁珠数量。使用过多的磁珠
将导致较高的背景，而使用过少的磁珠将导致较低的产量。每毫克磁珠通常可与1-20μg靶蛋白结合。
1.将适量的珠子转移到离心管中。将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
2. 取下试管，加入5倍磁珠溶液体积的PBS缓冲液，通过震荡重新悬浮磁珠，涡旋30
秒。将试管至于室温环境1-3分钟，再将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
3.重复步骤2 两次。
4. 向含有目标蛋白质的粗样品中添加洗涤过的磁珠，并在室温或所需温度下温浴1-2小时（温度越低，培养时间越长）。
提示：强烈建议进行滴定实验以优化培养时间。因为孵化的时间太长可能会导致很高的背景。
5. 用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl彻底清洗磁珠，直到280nm处洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。
提示：添加更高浓度的盐、非离子洗涤剂和还原剂也可能会降低非特异性背景。例如，向洗涤缓冲液中添加NaCl（浓度为1-1.5 M）、0.1-0.5%的非离子洗涤剂，如Triton X-100或Tween-20，以及还原剂，如DTT或TCEP（我们通常使用3mM）。
6. 通过适当的方法，如低pH（2-4）、高pH（10-12）、高盐、高温、亲和洗脱或SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸，洗脱目标蛋白。
7.切断二硫键
提升：由于配体之间的构象不同，用户应确定最佳工作条件，如还原剂、pH值和温度，以切割单个配体的二硫键。以下是从磁珠上切割共轭的GFP蛋白的示例。
1）在140 mMβ-巯基乙醇或5 mM DTT（二硫苏糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。
a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巯基乙醇条件下，室温2小时或
者过夜孵育，或者在98℃条件下5分钟。
b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT条件下，室温2小时或者过夜孵
育，或者在98℃条件下5分钟。
