产品中心
PRODUCT CENTER
糖蛋白和抗体结合试剂盒（I）
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货号 |
产品名称 |
产品规格 |
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FD106 |
BcMag™ 糖蛋白和抗体结合试剂盒（I） |
一个 |
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存储条件 |
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2.5µm BcMag™酰肼基磁珠 |
4℃ |
150mg |
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10x结合缓冲器 |
4℃ |
10ml |
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氧化剂（NaIO4） |
4℃ |
100mg |
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5 x洗涤缓冲液 |
4℃ |
15ml |
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10xPBS |
4℃ |
5.0ml |
储存：收到产品时，将试剂盒储存在4ºC。
在自然的条件下，大多数生物化合物不含羰基酮或醛。然而，蛋白质上其他类似的基团也可能有效地形成固定位点，该固定位点可以共价偶联目标物质。并且远离活性中心或结合区。糖复合物，如糖蛋白和糖脂，通常在相邻碳原子上含有具有羟基的糖残基。用高碘酸钠氧化这些顺式二醇就会产生可用作共价固定位点的醛基。
BcMag ™ 糖蛋白和抗体结合试剂盒使用酰肼基活化磁珠和特定催化剂，与糖蛋白和抗体产生亲和反应，这些糖蛋白和抗体的Fc部分通常有大量碳水化合物（糖基化）。本试剂盒通过氧化的碳水化合物基团，来固定糖基化蛋白（包括单克隆抗体），以产生可重复使用的亲和基质。这种使用酰肼基团化学固定的抗体，具有抗原结合位不会受到阻碍的有点，和对抗体具有优良的纯化能力。在含有催化剂的，简单的非胺缓冲液中，完全偶联只需要2至4小时。抗体和常见糖蛋白的偶联效率通常大于85%，每毫克的酰肼基磁珠可以固定15µg至20µg蛋白。用稳定的糖蛋白或抗体制备的基质可以再生并重复使用至少五次，而不会明显丧失结合能力。
BcMag ™ 酰肼基磁珠是在表面连接有高密度酰肼官能团的均匀磁珠。酰肼基磁珠可通过糖基化位点可有效的对糖蛋白进行标记、固定或偶联；这些位点通常（与大多数多克隆抗体一样）远离关键结合位点的结构部位，这样就完美的保留了这些关键结合位点的功能。以这种选择性地与靶向分子Fc部分的重链结合的方式偶联抗体，有助于Fv区域末端尽可能最好地保存抗原结合活性。在pH 5至7条件下，酰肼基的载体和化合物将与氧化碳水化合物的羰基结合，从而产生腙键（图1）。酰肼基磁珠结合较大的糖蛋白和糖脂，碳水化合物或其他配体。它的亲水性表面基团保证了磁珠在实验过程中，具有极低的非特异性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各种缓冲液中处理。
工作流程
本款磁珠可以完美地作为亲和树脂进行亲和纯化，将分子、细胞和部分细胞提取物进行提炼纯化。在与配体结合后，将磁珠添加到含有目标分子的样品中，然后混合、孵育、洗涤和洗脱目标分子。
功能和优点。
· 特异性的固定反应------酰肼基活化磁珠仅会与，已被高碘酸盐（例如唾液酸）轻度氧化的，含有糖基的纯糖蛋白结合。
· 稳定的共价键，低水平的配体泄漏
· 维持抗体功能-----通过Fc区固定IgG，保留两个抗原结合位点，均可用于靶目标的捕获。
· 极低的非特异性结合率
· 极高的固定容量：15-20µg抗体/mg磁珠。
操作协议
提示
l 强烈建议在实验过程中进行滴定优化，以确定每个实验中应用的磁珠数量。该协议可以相应地放大和缩小。
l 应避免使用含有伯胺基团或糖类的Tris或其他缓冲液，因为它们会与预期的
偶联反应物竞争结合磁珠。
所需耗材
1.磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择一下不同型号的磁力分离器：
BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);
BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);
BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);
BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);
BcMag™ separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).
2.Coupling Buffer: 0.1 M 磷酸钠, pH 7.0
3.氧化剂: Sodium meta-Periodate (NaIO4) (Sigma, Cat# S1878)
4.Washing Buffer: 1M NaCl
5.PBS
6. 2.5 μm BcMag™ 酰肼基磁珠
配体的偶联反应
A. 磁珠的准备
1.称取30 mg磁珠，并将其加入到1.5 ml离心管中。
2.加入1毫升coupling buffer，并通过涡旋或移液器吹吸方式将磁珠充分悬浮。
3.将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
4.将清洗的磁珠准备进行偶联反应。
B.糖蛋白或其他配体的氧化
注意：该反应对光敏感，应在黑暗中进行。
1.将0.5-10 mg糖蛋白或者其他配体溶解或稀释于1 ml Coupling Buffer中。（注：如果蛋白质或者其他配体已经悬浮在其他缓冲液中，则通过透析脱盐柱进行缓冲液交换。）
2.将蛋白质其他配体溶液添加到含有2 mg高碘酸钠（最终浓度为10 mM）的棕色小瓶中。轻轻旋转以溶解氧化剂。
3.在室温下，将样品在黑暗中缓慢旋转孵育45分钟。
C.偶联反应
1. 将氧化后的蛋白质或其他配体溶液添加到步骤A4制备的磁珠中，并通过旋转或移液器吹吸方式充分混合。
提示：偶联效率取决于目标糖蛋白或其他配体的结构和大小。用户应根据经验优化蛋白质与磁珠的比例。
2. 在室温下，在黑暗中孵育反应过夜，过程中保持充分混合
3. 将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。取下试管，用5ml的Coupling buffer通过涡悬或者吹吸重新悬浮磁珠。
4. 重复步骤3三次。
5. 用含有0.1%叠氮化物（w/v）的PBS缓冲液重新悬浮磁珠至所需浓度，在4°C下储存，直至使用。不要冷冻保存。
D、常见亲和纯化过程
提示：
l 该方案是一个通用的亲和纯化发法。因为没有两种蛋白质是完全相同的，所以不可能为所有的蛋白质纯化设计一个通用的协议。为了获得最佳结果，每个用户必须确定纯化单个目标蛋白的最佳工作条件。
l 强烈建议根据粗样品中目标蛋白质的含量，进行滴定，以优化每个单独实验中使用的磁珠数量。使用过多的磁珠
将导致较高的背景，而使用过少的磁珠将导致较低的产量。每毫克磁珠通常可与10-20μg靶蛋白结合。
1.将适量的珠子转移到离心管中。将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
2. 取下试管，加入5倍磁珠溶液体积的PBS缓冲液，通过震荡重新悬浮磁珠，涡旋30
秒。将试管至于室温环境1-3分钟，再将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。
3.重复步骤2 两次。
4. 向含有目标蛋白质的粗样品中添加洗涤过的磁珠，并在室温或所需温度下温浴1-2小时（温度越低，培养时间越长）。
提示：强烈建议进行滴定实验以优化培养时间。因为孵化的时间太长可能会导致很高的背景。
5. 用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl彻底清洗磁珠，直到280nm处洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。
提示：添加更高浓度的盐、非离子洗涤剂和还原剂也可能会降低非特异性背景。例如，向洗涤缓冲液中添加NaCl（浓度为1-1.5 M）、0.1-0.5%的非离子洗涤剂，如Triton X-100或Tween-20。
6. 通过适当的方法，如低pH（2-4）、高pH（10-12）、高盐、高温、亲和洗脱或SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸，洗脱目标蛋白。
