产品中心
PRODUCT CENTER
一步法抗体纯化试剂盒
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Cat. No. |
Product Name |
Unit Size |
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EB101 |
BcMag™ One-Step Antibody Purification Kit |
2 ml |
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EB102 |
BcMag™ One-Step Antibody Purification Kit |
10 ml |
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简介
BcMag™ 一步式抗体纯化试剂盒专为从人类、小鼠、大鼠、兔子、山羊、马、豚鼠、猪、仓鼠和驴等血清中快速小规模高通量纯化各种IgG种类而设计。与传统的结合-洗涤-洗脱亲和纯化方法不同，BcMag™ 一步法抗体纯化试剂盒通过清除血清中大量存在的非相关蛋白质，将抗体与血清分离。一步法抗体纯化磁珠可以结合血清中的非抗体蛋白质（如白蛋白和转铁蛋白），使抗体溶解在适和的缓冲液中通过磁珠，便于存储和下游应用。如果血清样品未溶血，可以直接将其应用到磁珠上，无需进行硫酸铵沉淀。
一步法抗体纯化试剂盒解决了常用的将蛋白A和蛋白G固定在固相载体上的纯化方法的缺点。使用蛋白A和蛋白G亲和技术可以选择性地结合IgG种类和亚类。这种技术通常非常耗时且繁琐，需要采用极端的洗脱条件来破坏亲和链接。纯化后的抗体通常需要透析或去盐处理后，才能存储或用于下游应用。一步法抗体纯化技术不需要洗脱步骤，而是在生理pH下使用适中的纯化缓冲液。此外，由于纯化后的抗体处于不含伯胺基的缓冲液中，因此可以直接用于胺基反应的结合化学反应。
磁珠产品与传统色谱法如纯化柱、琼脂糖或非磁性树脂相比具有显著优势。基于磁珠的特性可以在约20分钟内快速高产率处理96个样品，不同IgG种类抗体纯化产物获得超过80％纯度和超过90％回收率。当使用基于色谱柱的技术实验时，在科学研究实验室处理多个样品时，可能需要大量的手动移液操作。这种移液操作会造成实验和人之间目标生物分子产量的差异。实验人员和学生可能需要大量的培训和实践才能产生恒定的蛋白质产量。而且磁珠具有许多优点，例如它们易于使用，快速的实验方案，适用性以及高通量自动化和小型化处理的便利性等。
产品特点和优势：
• 高效 - 回收率超过90％，纯度超过85％。
• 快速纯化 - 一步法手动或一步法高通量操作。
• 便捷 -无需使用纯化柱、过滤器，且不需要繁琐的移液或离心操作。
• 不含胺基缓冲液 - 无需进行去除或中和操作。
• 结合力强 - 适用于对蛋白A或蛋白G结合能力较差的IgG亚类。
• 温和 - 无需苛刻的抗体洗脱条件，有助于保持IgG的活性。
• 可再生 - 磁珠可重复使用，可进行多达3次纯化。
工作流程（图1）：
向血清中加入磁珠。
通过慢速上下移液25次（一分钟）或旋转混匀器混合样品。
磁分离非抗体血清蛋白结合的磁珠，从而获得纯抗体。
将上清转移到一个新的试管中。
操作步骤：
提示：
• 以下 操作方案为示例。磁珠和样品体积可进行合理的放大或缩小。
• 每40µl磁珠可做用于3µl血清。磁珠用量少会产生杂质。使用过多的磁珠可能会降低目标抗体的产量。血清中的IgG水平通常为10-15mg/ml，但结果可能因物种和样品制备而异。
• 使用磁珠纯化后的样品中可能存在转铁蛋白，包括小鼠和大鼠血清样品。这些物种的转铁蛋白具有各种性质，不会像其他物种的转铁蛋白那样会和磁珠发生反应。纯化前，进行硫酸铵沉淀，可以降低转铁蛋白的存在。
仪器要求
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Item |
Source |
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磁力分离器
**根据样品体积，用户可以选择以下磁力分离器之一 |
l BcMag™ separator-2 适用于两个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag™ separator-6 适用于六个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag™ separator-24 适用于24个单独的1.5-2.0 ml离心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag™ separator-50 适用于1个单独的50毫升离心管，1个单独的15毫升离心管, 以及4个 1.5毫升 离心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分离器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分离器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可调单通道和多通道移液器 |
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摆斗离心机 |
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如果使用96孔PCR板/管，则需要添加项目 |
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涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf™ MixMate™ |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24 × 1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 离心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，确保PCR管或PCR板锥形部分底部的井径必须≥2.5毫米。 |
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如果使用96孔微孔板需要添加的设备 |
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Fisher Scientific™ Microplate Advanced Vortex Mixers |
Fisher, Cat#:02-216-101 |
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OHAUS Microplate Vortex Mixers |
OHAUS, Cat#:30392160 |
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涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥800 rpm |
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平底透明的非结合型分析微孔板 |
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实验步骤
重要提示：
• 以下方案针对3µl血清样品的高效纯化进行的优化。如果进行其他反应，则可能需要进行程序优化。
• 在使用前，摇晃或涡旋混合试剂瓶，完全重悬磁珠。
• 不要让磁珠静置超过两分钟。
1.将40µl磁珠转移到新的96孔PCR板、96孔微孔板或0.2ml PCR管的孔中，并加入3µl血清。
2.通过缓慢上下移液25次（一分钟）或旋转混匀器以2000rpm的速度混合磁珠和样品。
3.将样品板/管放在磁力分离板上，静置30秒至1分钟，直至磁珠完全分离并沿管壁靠近板底部。期间，磁珠将被磁力架吸附到磁力架上，而上清液将保留在样品管中。
4.使用多通道或单通道移液器，小心地从样品板/管中取出上清液，避免吸取到磁珠。
5.将上清液转移到新的96孔PCR板、96孔微孔板或其他目标容器中。至此，抗体已被高效纯化。
请注意，以上步骤仅为示例，并假定您使用了Bioclone的BcMag™ 一步式抗体纯化试剂盒。实际操作时，请根据试剂盒的使用说明进行操作，并注意确保实验操作在无菌环境下进行。
附加信息：
磁珠再生
1.如果必须再生磁珠，则需添加50µL 5M NaCl，并通过缓慢上下吹吸移液25次（1分钟）或通过涡流混合器在2000 rpm下搅拌5分钟，将磁珠与样品混合。将样品板/试管放在磁性分离板上30秒或直到溶液澄清。丢弃上清液。
2.重复步骤1五次。
3.用40µl 25mM MES，PH6.5重新悬浮磁珠，并在4°C下储存。磁珠可以被再生三次而不会失去实质上的选择性。
问题与建议
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问题 |
可能原因 |
建议 |
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纯化抗体的产量太低或检测不到 |
样品中抗体的含量太低 |
• 使用其他方法，如ELISA或同类型试剂盒，确保样品含有IgG。 |
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样品中抗体未与磁珠结合 |
• 确保样品缓冲液中的 pH值在 6.5 - 7.0范围内. |
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观察到染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上存在多条条带 |
样品中含有大于25mM的盐，同时pH值可能不是中性的。 |
• 使用低盐中性缓冲液对样品进行透析。 • 确保样品缓冲液中的 pH值在 6.5 - 7.0范围内. |
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纯化出大量抗体。然而，没有发现目标抗体 |
目标抗体浓度太低 |
• 利用活性亲和磁珠和特异性抗原纯化抗体。 |
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纯化的IgG被染色 |
对血清样品进行溶血。 |
溶血的消除
以下操作可用于减少或消除血清样品中的溶血。 •在抗凝血剂存在的情况下采集血液并离心以去除红细胞。
•谨慎采血，避免溶血。
•收集间质液而不是血液。 |
