可分离式NHS活化磁珠

胺基基团（-NH2）是固定蛋白质分子最常见功能基团：该基团可以在每个多肽链（称为α-胺）的N末端和赖氨酸（Lys，K）残基（称为ε-胺）的侧链中找到。由于伯胺基团在生理条件下带正电荷，因此它们通常分布在蛋白质的外部（即在外表面）；所以在与它们结合过程中，不会使蛋白质结构发生变性。

BcMag ™ 可分离式NHS活化磁珠是均匀的，表面涂有高密度NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）官能团的磁珠。磁珠利用可靠的NHS酯进行化学固定，不需要使用危险化学品。而且本磁珠具有较低的非特异性结合率，并且不会造成偶联配体的泄漏。通过形成稳定的酰胺键，偶联效率超过85%，该磁珠可以快速，有效地共价结合任何含伯胺的配体。Bioclone 可分离式NHS活化磁珠反应仅需不到一个小时（在室温pH 7-9下为15-30分钟，在4°C下为4小时），就可以产生非常稳定的连接。由于NHS基团通过内置的可切割二硫键连接物（图1）与磁珠连接，因此，可用还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）从磁珠上切割并分离出目标分子-配体的复合物。此外，它的亲水性表面基团保证了磁珠在实验过程中，具有极低的非特异性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各种缓冲液中处理。

产品独特的干燥状态避免了丙酮溶剂储存的麻烦，或液体去除和处理的需要。此外，由于干基质在膨胀时浓缩样品，减少了起始材料的体积，并且会提高配体固定化的效率，因此它非常适合与浓度较低样品进行偶联反应。

 工作流程

本磁珠作为固体载体可以完美地用于各种亲和纯化，将分子，细胞和部分细胞进行纯化。只需要与配体结合后，将磁珠添加到含有目标分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脱目标分子（图2）

图2

特点和优势：

l 预活化，即用型磁珠

l 含有一个可切割的内置二硫键，可将配体-目标分子复合物从磁珠中分离出来。

l 配体-目标分子复合物可以从磁珠上分离出来

l 便于使用

l 在pH7.4，4℃-25℃条件下可以快速偶联

l 稳定的共价键，低水平的配体泄漏 

l 可重复使用的免疫亲和基质           

l 极低的非特异性结合率 

l 可固定15-20ug蛋白/mg的磁珠 

l 用途：用于纯化抗体，蛋白质/肽，DNA / RNA;细胞筛选、免疫沉淀

操作协议

提示：

l 强烈建议在实验过程中进行滴定优化，以确定每个实验中应用的磁珠数量。该协议可以相应地放大和缩小。

l 避免使用含有还原剂、tris或其他含有伯胺或其他亲核类试剂的缓冲液，因为它们会破坏二硫键连接物或与预期的偶联反应竞争。但wash buffers和 storage buffers 可含有氨基或羧基成分。

A.所需耗材

1.磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择一下不同型号的磁力分离器：

BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);

BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);

BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);

 BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);

BcMag™ separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).

2.Coupling Buffer: 0.1M磷酸钾，0.15 M NaCl，pH 7.4 

3.Wash Buffer: 0.05 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.

4. Blocking Buffer: 1 M乙醇胺, pH 9.0

B.磁珠的准备

1.用丙酮（30 mg/ml）制备3%的磁珠，并充分混合。

提示：将未使用的磁珠可以在丙酮溶液中，储存在4℃。可保存一年时间。

2.将100µl（3mg）的磁珠转移到离心管中。

3. 将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。从磁力分离器上取下试管，加入1ml的coupling buffer用通过涡旋30秒重新悬浮磁珠。

4.重复步骤3 两次。

5.去除上清液，将清洗的磁珠准备进行耦合反应。

注：使用coupling buffer重新水化后，由于官能团的稳定性，应尽快使用磁珠。

C.蛋白质的偶联

提示：NHS活化磁珠的偶合效率因配体而异。用户可应根据经验优化配体的浓度。蛋白质的建议结合浓度为0.5-10 mg/ml。对于小分子多肽，配体浓度应至少为200μmol /ml。

1.用coupling buffer制备100µl蛋白质溶液（0.5-1mg/ml）或多肽溶液（200μmol/ml）并与上述清洗过的磁珠混合。如果样品已经悬浮在另一个缓冲液中，用等量的coupling buffer稀释样品。

 2. 在室温条件下，连续旋转孵育4-6小时或者过夜。提示：使用者应该对反应时间进行优化

 3.将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。从磁力分离器上取下试管，加入1ml的coupling buffer用通过涡旋30秒重新悬浮磁珠；再将试管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。

4.用1ml的Washing buffer(或者 1 M NaCl)清洗磁珠，重复3-4次。

 5. 向磁珠中添加0.5-1ml的blocking buffer(BSA也可以封闭磁珠, PBS, pH7.4, 0.1%BSA)，并在室温下培养1小时或在4°C下过夜。

 6. 用1ml预冷的Washing buffer将磁珠洗涤3次。

 7. 用 pH 7.4含有0.1% BSA，0.01%叠氮化物（w/v）的PBS缓冲液重新悬浮磁珠至所需浓度，并在4℃下储存，直至使用。不要冷冻保存。

D．常见亲和纯化过程

提示：

l 该方案是一个通用的亲和纯化发法。因为没有两种蛋白质是完全相同的，所以不可能为所有的蛋白质纯化设计一个通用的协议。为了获得最佳结果，每个用户必须确定纯化单个目标蛋白的最佳工作条件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用还原剂。

l 强烈建议根据粗样品中目标蛋白质的含量，进行滴定，以优化每个单独实验   

中使用的磁珠数量。使用过多的磁珠将导致较高的背景，而使用过少的磁珠将导致较低的产量。每毫克磁珠通常可与1-20μg靶蛋白结合。

1.将适量的珠子转移到离心管中。将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全沉淀时，去除上清液。

2. 取下试管，加入5倍磁珠溶液体积的PBS缓冲液，通过震荡重新悬浮磁珠，涡旋30

秒。将试管至于室温环境1-3分钟，再将管放在磁力分离器上1-3分钟。当磁珠完全

沉淀时，去除上清液。

3.重复步骤2 两次。

4. 向含有目标蛋白质的粗样品中添加洗涤过的磁珠，并在室温或所需温度下温浴1-2小

时（温度越低，培养时间越长）。

提示：强烈建议进行滴定实验以优化培养时间。因为孵化的时间太长可能会导致很高的背景。

5. 用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl彻底清洗磁珠，直到280nm处洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

    提示：添加更高浓度的盐、非离子洗涤剂和还原剂也可能会降低非特异性背景。例如，向洗涤缓冲液中添加NaCl（浓度为1-1.5 M）、0.1-0.5%的非离子洗涤剂，如Triton X-100或Tween-20，以及还原剂，如DTT或TCEP（我们通常使用3mM）。

6. 通过适当的方法，如低pH（2-4）、高pH（10-12）、高盐、高温、亲和洗脱或SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸，洗脱目标蛋白。

7.切断二硫键

提升：由于配体之间的构象不同，用户应确定最佳工作条件，如还原剂、pH值和温度，以切割单个配体的二硫键。以下是从磁珠上切割共轭的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巯基乙醇或5 mM DTT（二硫苏糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巯基乙醇条件下，室温2小时或

者过夜孵育，或者在98℃条件下5分钟。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT条件下，室温2小时或者过夜孵

育，或者在98℃条件下5分钟。