高纯度中量质粒DNA纯化试剂盒

快速中量质粒DNA纯化试剂盒，为分离高质量质粒DNA提供了一种快速，简便，可靠的方法。该试剂盒设计在20分钟内纯化多达100μg的质粒DNA，具有简单有效的方案，提取出适用于分子克隆或其他下游应用的超纯质粒DNA

质粒是环状的染色体外DNA分子，在分子生物学中充当特定DNA片段的载体。再通过细菌来复制质粒，从而可以大规模生产所需的DNA。研究人员从细菌中获得质粒的方法称为质粒提取。

从细菌细胞中提取质粒DNA是克隆的关键步骤。细菌细胞在质粒纯化过程中被裂解，从而让细胞中DNA和其他生物成分释放出来。在去除掉大多数细胞成分后，将含有质粒DNA与基因组DNA的DNA的裂解液进行分离。

提取的质粒DNA的质量与通过两次通过氯化铯梯度纯化产生的质粒DNA的质量相同，这是DNA纯化最传统的方法。高质量的DNA可以在不到二十分钟的时间内被提取，用于转染和其他应用。不需要额外的过程来去除RNA，蛋白质或内毒素等杂质。此外，《使用说明》操作过程不需要使用苯酚、氯仿、溴化乙锭和氯化铯，减少了有害化合物的暴露和处置。

原理和工作流程（图1）

BcMag ™ 高纯度中量质粒DNA纯化使用弱阴离子交换磁珠快速纯化质粒DNA。磁珠可以与质粒DNA直接结合。这种方法使用传统的细胞悬浮，碱性裂解和中和过程，并将质粒DNA直接结合到磁珠上。再对磁珠进行清洗去除杂质，如RNA，蛋白质，代谢物和其他低分子量分子。独特的清洗缓冲液可确保消除无机盐，蛋白质，RNA和其他生物成分，从而获得浓缩的高纯度DNA。随后用高盐缓冲液洗脱高纯度的质粒DNA。再对DNA进行脱盐，用异丙醇沉淀洗脱的质粒浓缩，然后离心。整个提取过程大约需要20分钟才能完成。

功能和优点

· 操作简单-不需要离心柱或过滤器。

· 快速-在不到二十分钟的时间内纯化质粒DNA。

· 无需苯酚/氯仿萃取

· 低内毒素

· 高质量-DNA适用于大多数下游应用

· 可轻松调整提取样本反应体积，便于自动化操作

· 可重复的结果

操作协议

所需材料

A. 缓冲液组成

· 所需材料：BcMag™ 质粒提取DNA磁珠。

· TE缓冲液：10mM Tris.HCL PH8  0.1mM EDTA

· 异丙醇（Sigma cat#19516）

· P1（重悬缓冲液）：50mM Tris.HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100ug/ml核糖核酸酶A（加入核糖核酸酶A后保存在4℃）

· P2（裂解缓冲液）：200mM NaOH，1%SDS（w/v）

· P3（中和缓冲液）：3.1M乙酸钾，pH 5.5（保存在4°C）

· P4（平衡缓冲液）：750mM NaCl，50mM MOPS，pH 7.0，15%异丙醇（v/v），0.15%Triton X-100（v/v）

· P5（洗涤缓冲液）：1.0 M NaCl，50mM MOPS PH 7.0，15%异丙醇（v/v）

· P6（洗脱缓冲液）：2.5 M NaCl，50mM Tris.HCl，pH8.5，15%异丙醇（v/v）

B. 所需设备

a. 磁力分离器（手动操作）

根据样品体积，用户可以选择以下磁力架之一：

• BcMag™ separator-2可以容纳两个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-01);

· BcMag™ separator-6可以容纳六个单独的1.5 ml离心管(Cat.# MS-02);

· BcMag™ separator-24可以容纳24个单独的1.5-2.0 ml离心管(Cat.# MS-03);

· BcMag™ separator-50可以容纳一个单独的50 ml离心管，一个15ml的离心管，以及四个1.5ml离心管(Cat.# MS-04);

· BcMag 96-孔磁力分离器(单面) 可与96孔PCR板和96孔微孔板或其他型号离心板兼容使用 (Blioclone,  Cat#: MS-06)；

· 对于大规模净化，陶瓷磁体块用于大规模净化（6英寸x 4英寸x 1英寸块铁氧体磁体，应用磁体，Cat#Ceramic-B8）

b. 用于大规模纯化的康宁430825细胞培养瓶（Cole Parmer，Cat#EW-01936-22）

c. Mini BlotBoy 3D摇床，定速，小型10“x 7.5”平台，带平板垫（Benchmark Scientific，Inc.Cat#B3D1008）或同类型产品

C. 操作过程

**该方案基于具有高拷贝质粒的50 ml细菌培养物。然而，该方案可以根据细菌培养量适当放大或缩小。

1. 细菌溶解

a. 将50ml过夜细胞培养物转移至离心管中，以6000 rpm离心10分钟，并除去上清液。

b. 用4ml P1缓冲液完全重悬细菌沉淀，轻轻加入4ml P2缓冲液混合，通过缓慢颠倒混匀在室温下孵育5分钟。

c. 加入4ml缓冲液P3，通过颠倒轻轻混合，在室温下以12000-16000 rpm离心10分钟，并小心转移上清液。（如有必要，将上清液通过六层粗棉布过滤）至新鲜管中。

2. 质粒纯化

a. 震荡试剂瓶，直到磁珠变得均匀，然后将1ml磁珠转移到新的试管中。

注意：在分配之前，不要让磁珠静置超过3分钟。每3分钟重悬一次磁珠。

b. 将试管放在磁力架上1-3分钟。当样品板保持在磁力分离器上时，将上清液去除。加入10倍磁珠体积的P4缓冲液，并通过移液或涡旋混合磁珠。再次将试管放在磁性支架上1-3分钟，当样品板保持在磁力分离器上时，将上清液去除。

c. 将磁珠与细胞裂解液混合（step1c），在Mini BlotBoy 3D摇床上在室温下连续旋转孵育5-10分钟，然后将试管放在磁力架上1分钟，直到它变清澈，然后除去上清液。

d. 使用磁力架用6ml P5缓冲液清洗磁珠三次。

e. 向磁珠中加入1ml洗脱缓冲液，并通过上下移液15-20次完全重悬磁珠。将试管置于磁力架上1-3分钟，并将上清液转移到新管中。

3. 质粒沉淀

a. 加入700ul异丙醇，充分混合，在室温下孵育2分钟，并在室温下以14000-16000 rpm离心10分钟。

b. 小心地取出上清液，用600ul 70%乙醇洗涤沉淀，以14000-16000 rpm离心4分钟，

c. 小心地取出上清液并将沉淀风干5-10分钟。（**不要过度干燥颗粒。否则颗粒很难分解）。

d. 用所需量的TE缓冲液重悬沉淀。（**在1%琼脂糖凝胶上运行2-3 ul质粒溶液以检查质量。如果存在RNA，则添加RNAse A以完全去除RNA）

质粒纯化常见问题

你建议什么样的培养条件？

培养物应从单个菌落接种，并在适当的抗生素存在下在培养基中培养。从起始培养物中进行亚培养也是可行的，但结果可能会有所不同。当培养物从对数期进入稳定期时，应收获细胞，以确保存在最大量的DNA而细胞裂解最少。单个菌落可用于接种在中高拷贝质粒的正常克隆过程中，于37°C培养12-16小时的5-10 ml培养物。1-3 ml的这种培养物应该可以产生3-6µg的高拷贝质粒或1-2µg的中拷贝质粒。较低拷贝的质粒将导致较低的产量，这可以通过处理较大的培养体积，同时缩放P1-B6缓冲液或浓缩纯化的DNA来解决。

什么因素影响质粒DNA的回收？

一些因素可以影响制备前和制备过程中的质粒回收率。质粒拷贝数，质粒大小，插入毒性，宿主菌株，抗生素选择，生长培养基和培养条件可以影响最终的质粒回收率。适当时选择高拷贝质粒，并将总大小保持在10kb以下以获得更高的产量。尽管产量较低，但可以分离出较大的质粒（高达25 kb）。在生长过程中保持抗生素选择可确保质粒不会丢失，并且培养物不会被没有质粒的快速增长的细胞群淹没。适当的通气和生长温度确保对数细胞生长，细胞裂解很少。

利用低拷贝质粒时应该怎么做？

通过确保培养物在最佳通气条件下培养并在主要细胞裂解发生之前除去，增加含有质粒的完整细胞的数量。低拷贝质粒的回收率总是低于高拷贝质粒的回收率。使用更多的细胞可以弥补部分不足，但要遵循这些参数，以确保碱裂解是有效的，并且珠子不会被细胞成分淹没。

你建议使用哪种文化媒体？

可以使用富媒体，例如2X YT或Terrific Broth。然而，它们通常在饱和时导致更大的细胞密度。因此，当使用富培养基时，必须减少处理的培养物量，以避免由于生物量较大而导致的碱裂解不足和柱超载。我们建议在LB（Luria-Bertani）培养基中培养大肠杆菌。

你推荐哪种大肠杆菌菌株？

最常见的实验室克隆菌株可用作质粒繁殖的宿主，用于miniprep纯化。Thermofisher提供合适的菌株，例如DH5α（Thermo Scientific#18258012）或DH10B（Thermo Scientific#EC0113）。

质粒是否用不含内毒素的珠子回收？

尽管弱阴离子交换珠和缓冲液从样品中去除了绝大多数内毒素，但回收的DNA不能保证不含内毒素。我们已经成功地用质粒DNA转染了强大的细胞系。虽然一些制造商可能声称他们的minipreps试剂盒是“无内毒素的”，但通常存在一些可定量的内毒素。

质粒miniprep后哪些因素影响my（A260/A280）？