产品中心
PRODUCT CENTER
一步法 DNA 荧光染料清除试剂盒
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货号 |
产品名称 |
产品规格 |
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AK101 |
BcMag™ 一步法 DNA 荧光染料清除试剂盒 |
1 ml |
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AK102 |
BcMag™ 一步法 DNA 荧光染料清除试剂盒 |
5 ml |
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"使用我们的一步法DNA荧光染料清除试剂盒可以从您的样品中纯化高品质的荧光标记DNA。简化的方案，可靠的结果和简单的操作使其成为您标记DNA纯化需求的完美选择。
简介
荧光染料，也称为活性染料或荧光团，是一种天然或合成的化合物，可以吸收光并以更长的波长重新发光。由于荧光染料的多功能性、高灵敏度和定量能力等独特优势，荧光染料被广泛用于标记蛋白质、抗体、多肽、配体、DNA和RNA等生物相关分子，用于细胞生物学、免疫学、生物化学、微生物学、分子生物学、基因组学和蛋白质组学研究。荧光标记反应完后，通常需要从最终的共轭反应体系中去除多余或未反应的染料，因为它会干扰许多下游应用。去除荧光染料方法通常使用离心柱法、凝胶过滤法或重力流柱和透析法等方式来完成。然而，这些传统方法存在许多问题，包括费时费力的操作过程，蛋白质、多肽或核酸的回收率低，以及不适应自动化的程序。为此，我们研发出了一种新型的一分钟脱色系统。
BcMag™ 一步法 DNA 荧光染料清除试剂盒采用独特设计和专利表面化学修饰的磁珠，专门去除生物分子标记反应中多余的游离（非共轭）荧光染料。本款磁珠操作方便仅需单步单管，完成净化方案只需1分钟，实际操作时间非常短（图1）。本款磁珠可以在不到10分钟的时间内同时处理96个样品。由于磁珠表明的磁性树脂材料只吸附游离染料，标记的生物分子回收率极高且>90%。此外，如果使用适当的样品量和缓冲条件，磁珠可以去除绝大部分染料(表1).。
表 1
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荧光染料 |
结合能力 ng /mg beads** |
荧光染料 |
结合能力 ng /mg beads** |
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Alexa Fluor 546 C5-Maleimide |
99.7 |
Alexa Fluor™ 514 NHS Ester |
45.2 |
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Cyanine 3 carboxylic acid |
99.1 |
Cyanine 5 carboxylic acid |
49.7 |
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Cyanine 3 amine |
99.3 |
Cyanine 3.5 carboxylic acid |
99 |
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Cyanine 5.5 amine |
99.8 |
Cyanine 5.5 carboxylic acid |
99.7 |
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Cyanine 5 amine |
49.85 |
Sulfo-Cyanine 5.5 amine |
99.9 |
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Sulfo-Cyanine3 amine |
93.3 |
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid |
24.9 |
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DyLight™ 488 NHS Ester |
90.5 |
DyLight™ 633 NHS Ester |
87.4 |
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Dylight 680-4x PEG NHS Ester |
99.8 |
DyLight™ 405 NHS Ester |
99 |
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Oregon Green™ 488 carboxylic acid |
84.2 |
FAM amine, 5-isomer |
24.57 |
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Rhodamine 5B amine |
99.2 |
Texas Red™ hydrazide |
890 |
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Cibarcron blue F3GA |
99.7 |
Fluorescein isothiocyanate |
120.3 |
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Bromocresol purple |
105.2 |
Phenol red |
99.5 |
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Denim red |
101 |
Bromophenol blue |
99 |
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Denim blue |
104.2 |
SYBR® dye |
102.4 |
**结合能力测定条件：在0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH7缓冲液中，将10µl磁珠（100 mg/ml）和100µl含有不同的染料浓度为50 ng-800 ng的蛋白质样品（1:400稀释的人血清）混合。并以2000 rpm的转速旋转5分钟。染料去除率>93%，蛋白质回收率>95%。
工作流程
使用程序非常简单（图1）。1.直接将磁珠添加到样品中。2.用移液器吹吸或涡旋方式捕捉游离染料。3.磁珠从蛋白质或DNA/RNA溶液中分离出来，而上清液中含有纯化后的生物样品。
优势及特点
l 简单的操作过程：无液体转移，仅需一管，一步操作，过程仅需1分钟
l 方便快捷
l 结果真实可靠可重复性高：对于蛋白质（>6 kDa，抑肽酶）或DNA/RNA（>25mer双链DNA）样品回收率>90%。
l 高效的清除效率：去除过量的引物（<100-mer ssDNA），二聚体，衔接子，无机盐，如Mg2+，洗涤剂，dNTPs，酶和染料。
l 性价比高：无需离心柱、过滤器、不用反复的重复移液和使用有机试剂。
l 可用于高通量实验：与许多不同的全自动核酸提取系统兼容。
操作协议
A. 用户所需材料
· 18.2 MΩ.cm,无 DNase/Rnase超纯水
· Triton™ X-100, Sigma, Catalog # T8787
· 其他
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Item |
Source |
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磁力分离器
**根据样品体积，用户可以选择以下磁力分离器之一 |
l BcMag™ separator-2 适用于两个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag™ separator-6 适用于六个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag™ separator-24 适用于24个单独的1.5-2.0 ml离心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag™ separator-50 适用于1个单独的50毫升离心管，1个单独的15毫升离心管, 以及4个 1.5毫升 离心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分离器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分离器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可调单通道和多通道移液器 |
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摆斗离心机 |
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如果使用96孔PCR板/管，则需要添加项目 |
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涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf™ MixMate™ |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24 × 1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 离心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，确保PCR管或PCR板锥形部分底部的井径必须≥2.5毫米。 |
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B.操作过程
重要提示：
1. 以下过程是经过优化的用于高效纯化10µl DNA样品。该实验条件可以根据需要扩大或缩小实验体积。如果应用于其他体积的反应条件，则需要对操作步骤进行优化。
2. 使用前震动试剂瓶，使磁珠完全重新悬浮，直至均匀。
3. 在分液完成前，不要让磁珠溶液静置停留超过2分钟。
4. 如果待纯化反应溶液中含有超过0.5%的有机溶剂，例如待纯化溶液中的DMSO（二甲基亚砜）含量，则用dH2O将有机溶剂浓度稀释至0.2-0.5%（最终）范围。
5、根据实验要求，用户可根据表2选择缓冲条件。例如，如果样品不含去垢剂，加入1ul的1%Triton™ X-100溶液至10μL样品中（则样品中去垢剂终浓度为0.1%）。
6. 核酸定量：仅可使用荧光方法检测，如qPCR、Qubit和Pico Green。
表2
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DNA 片段清除 |
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DNA |
+ 0.1% Triton x-100, pH7.5 |
- 0.1% Triton x-100 pH7.5 |
+ 0.1% Triton x-100 pH 8.0 |
- 0.1% Triton x-100 pH 8.0 |
+ 0.1% Triton x-100 pH 8.8 |
- 0.1% Triton x-100 pH 8.8 |
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dsDNA (100 bp) |
未清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (150 bp) |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (200 bp) |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (300 bp) |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
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ssDNA 100 mer |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
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dsDNA- 双链 DNA; ssDNA- 单链 DNA上 述验证时通过下列条件完成的: 1. 10 mM Tris-HCl 含有或者不含有 0.1% triton (最终含量) 以及以下三个变量: pH 7.5, pH 8.0 和 pH 8.8 |
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1. 添加5ul磁珠产品到10ul的DNA待纯化样品中。
2. 如果需要，可短暂的2500rpm离心30秒，使所有成分都处于试管底部
3. 彻底混匀1分钟，通过缓慢的使用移液器吹吸25次（一分钟时间）；或者2500 rpm
涡旋震荡5分钟。
4. 如果需要，可短暂的2500rpm离心30秒，使所有成分都处于试管底部
5. 将装有样品的试管放入磁力分离器中30秒，直到磁珠彻底被吸附到试管底部，上清
液变澄清为止。
6. 将试管保持在磁力分离器中，同时，将上清液转移到一个干净的试管当中，用于下
游实验。
C.故障排除
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DNA回收率低 |
涡旋时间太长 或者涡旋速度太快 |
· 减少涡旋时间或者速度 · 如果使用其他型号的涡旋混匀器，则涡旋时间和速度需要重新优化 |
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磁珠使用过多 |
彻底的悬浮磁珠，并准确的加入磁珠的用量 |
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DNA回收率低 |
样品缓冲液未优化 |
· 如果样品中不含有去垢剂，向样品中添加曲通拉X-100（最终浓度为0.1%） |
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杂质去除失败 |
PCR 管或者PCR 板型号不对 |
确保PCR 管或者PCR 板的底部圆锥形截面直径≥2.5mm. |
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涡旋的速度太慢或者涡旋时间太短 |
· 增加涡旋的速度或者涡旋时间 · 如果使用其他型号的涡旋混匀器，则涡旋时间和速度需要重新优化. |
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磁珠使用量太少 |
彻底的悬浮磁珠，并准确的加入磁珠的用量 |
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DNA片段有较强的二级结构 (<50bp dsDNA or < 100 mer ssDNA) |
通过95°C加热2分钟使样品变性 |
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有太多的引物，二聚体，衔接体，游离染料或者去垢剂 |
· 增加磁珠使用量 · 进行第二次纯化，按照相同的纯化过程 |
