产品中心
PRODUCT CENTER
一步法染料清除磁珠
|
货号 |
产品名称 |
产品规格 |
|
|
BG101 |
BcMag™ 一步法染料清除磁珠 |
1 ml |
|
|
BG102 |
BcMag™ 一步法染料清除磁珠 |
5 ml |
|
|
产品信息 |
|
|
组成 |
二氧化硅基质，表面覆盖有高密度专有化学基团的磁珠 |
|
稳定性 |
短期保存 (<1小时): pH 3-11; 长期保存: pH 4-10 温度: 4°C -140°C; 可溶于大多数有机溶剂 |
|
磁化强度 |
~40-45 EMU/g |
|
磁化类型 |
超顺磁 |
|
成分 |
100 mg / ml溶于d2H2O |
|
储存 |
室温运输，收到后保存在 4°C . |
简介
荧光染料，也称为活性染料或荧光团，是一种天然或合成的化合物，可以吸收光并以更长的波长重新发光。由于荧光染料的多功能性、高灵敏度和定量能力等独特优势，荧光染料被广泛用于标记蛋白质、抗体、多肽、配体、DNA和RNA等生物相关分子，用于细胞生物学、免疫学、生物化学、微生物学、分子生物学、基因组学和蛋白质组学研究。荧光标记反应完后，通常需要从最终的共轭反应体系中去除多余或未反应的染料，因为它会干扰许多下游应用。去除荧光染料方法通常使用离心柱法、凝胶过滤法或重力流柱和透析法等方式来完成。然而，这些传统方法存在许多问题，包括费时费力的操作过程，蛋白质、多肽或核酸的回收率低，以及不适应自动化的程序。为此，我们研发出了一种新型的一分钟脱色系统。
BcMag™ One-Minute Dye Removal Magnetic Beads采用独特设计和专利表面化学修饰的磁珠，专门去除生物分子标记反应中多余的游离（非共轭）荧光染料。本款磁珠操作方便仅需单步单管，完成净化方案只需1分钟，实际操作时间非常短（图1）。本款磁珠可以在不到10分钟的时间内同时处理96个样品。由于磁珠表明的磁性树脂材料只吸附游离染料，标记的生物分子回收率极高且>90%。此外，如果使用适当的样品量和缓冲条件，磁珠可以去除绝大部分染料。
工作流程
使用程序非常简单（图1）。1.直接将磁珠添加到样品中。2.用移液器吹吸或涡旋方式捕捉游离染料。3.磁珠从蛋白质或DNA/RNA溶液中分离出来，而上清液中含有纯化后的生物样品。
优势及特点
l 简单的操作过程：无液体转移，仅需一管，一步操作，过程仅需1分钟
l 方便快捷
l 结果真实可靠可重复性高：对于蛋白质（>6 kDa，抑肽酶）或DNA/RNA（>25mer双链DNA）样品回收率>90%。
l 高效的清除效率：可去除95%的游离染料
l 性价比高：无需离心柱、过滤器、不用反复的重复移液和使用有机试剂。
l 可用于高通量实验：与许多不同的全自动核酸提取系统兼容。
操作协议
材料准备
|
Item |
Source |
|
|
磁力分离器
**根据样品体积，用户可以选择以下磁力分离器之一 |
l BcMag™ separator-2 适用于两个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag™ separator-6 适用于六个单独的1.5毫升离心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag™ separator-24 适用于24个单独的1.5-2.0 ml离心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag™ separator-50 适用于1个单独的50毫升离心管，1个单独的15毫升离心管, 以及4个 1.5毫升 离心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
|
|
|
BcMag 96孔磁力分离器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分离器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
|
|
可调单通道和多通道移液器 |
|
|
|
摆动式离心机 |
|
|
|
如果使用96孔PCR板/管，则需要添加项目 |
||
|
涡悬混合器 **用户还可以使用其他型号的涡悬混合器。但是，时间和速度应进行优化，并且混合器应满足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 转速 ≥ 2000 rpm |
||
|
Eppendorf™ MixMate™ |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
|
|
Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
|
|
Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24 × 1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
|
|
Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
|
|
1.5/2.0 mL 离心管 |
||
|
96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
||
|
PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，确保PCR管或PCR板锥形部分底部的井径必须≥2.5毫米。 |
||
操作过程
重要提示：
l 以下操作过程仅是个例。操作过程中磁珠用量以及样品体积可以根据需要放大或缩小。不要使用含有有机溶剂的缓冲液。
l 用户应根据表1中列出的结合能力优化磁珠和染料浓度的比例。
表1：染料结合力表
|
荧光染料 |
结合能力 ng /mg beads** |
荧光染料 |
结合能力 ng /mg beads** |
|
Alexa Fluor 546 C5-Maleimide |
99.7 |
Alexa Fluor™ 514 NHS Ester |
45.2 |
|
Cyanine 3 carboxylic acid |
99.1 |
Cyanine 5 carboxylic acid |
49.7 |
|
Cyanine 3 amine |
99.3 |
Cyanine 3.5 carboxylic acid |
99 |
|
Cyanine 5.5 amine |
99.8 |
Cyanine 5.5 carboxylic acid |
99.7 |
|
Cyanine 5 amine |
49.85 |
Sulfo-Cyanine 5.5 amine |
99.9 |
|
Sulfo-Cyanine3 amine |
93.3 |
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid |
24.9 |
|
DyLight™ 488 NHS Ester |
90.5 |
DyLight™ 633 NHS Ester |
87.4 |
|
Dylight 680-4x PEG NHS Ester |
99.8 |
DyLight™ 405 NHS Ester |
99 |
|
Oregon Green™ 488 carboxylic acid |
84.2 |
FAM amine, 5-isomer |
24.57 |
|
Rhodamine 5B amine |
99.2 |
Texas Red™ hydrazide |
890 |
|
Cibarcron blue F3GA |
99.7 |
Fluorescein isothiocyanate |
120.3 |
|
Bromocresol purple |
105.2 |
Phenol red |
99.5 |
|
Denim red |
101 |
Bromophenol blue |
99 |
|
Denim blue |
104.2 |
SYBR® dye |
102.4 |
**结合能力测定条件：在0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH7缓冲液中，将10µl磁珠（100 mg/ml）和100µl含有不同的染料浓度为50 ng-800 ng的蛋白质样品（1:400稀释的人血清）混合。并以2000 rpm的转速旋转5分钟。染料去除率>93%，蛋白质回收率>95%。
1. 将样品pH值调整至6.5至9.0，并将NaCl浓度调整至150 mM。
2.震动试剂瓶，使磁珠完全重新悬浮，直至均匀。
重要提示：
l 分液前必须将磁珠混合。
l 在分液完成前，不要让磁珠溶液静置停留超过2分钟。每2分钟重新悬浮一次磁珠。
3.向含有游离洗涤剂的100µl样品中添加10µl磁珠。
重要提示：由于染料的结合能力不同，样品中染料的浓度也不同，用户需要优化磁珠和生物样品添加的比例。
4. 在1-2分钟内缓慢上下移液吹吸20-25次，将样品与磁珠混合。
5.将含有样品的试管放在磁力分离器上30秒或直到溶液澄清。
6.将上清液转移到另一个干净的板/管中，同时将原样品板保留在磁力分离器上。纯化好的样品已可以用于下游应用。
问题及解决
|
问题 |
可能原因 |
建议 |
|
蛋白回收率低 |
涡旋时间太长
|
· 如果使用其他型号的涡旋振荡器，则必须优化涡旋条件，如速度和时间。 |
|
磁珠用量太多 |
完全重新悬浮磁珠，并减少磁珠的用量。 |
|
|
染料清除失败 |
使用了不合适的PCR试剂管或PCR板 |
确保试剂管或板锥形部分底部的井径为≥2.5毫米。 |
|
涡旋速度太慢或者涡旋时间太短
样品中含有太多游离的染料 |
· 增加速度或者时间 · 如果使用其他型号的涡旋振荡器，则必须优化涡旋条件，如速度和时间。 · 重复操作过程使用更多的磁珠 |
参考文献
1. Hayashi-Takanaka, Yoko et al. "Evaluation of chemical fluorescent dyes as a protein conjugation partner for live-cell
imaging." PloS one vol. 9,9 e106271. 3 Sep. 2014,
2. Gui, W., Lin, J., Liang, Y. et al. A two-step strategy for high-efficiency fluorescent dye removal from wastewater. npj Clean
Water 2, 16 (2019).
3. Hoffman A, Atreya R, Rath T, Neurath M, F: Use of Fluorescent Dyes in Endoscopy and Diagnostic Investigation. Visc Med
2020;36:95-103.
4. Hawe, Andrea et al. “Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.” Pharmaceutical research vol. 25,7
(2008): 1487-99.
